股票k线平台 英坦科技（Intan Technologies）多通道放大器小鼠上丘中缺乏关于定型方向柱的证据

视觉系统中的神经元可以根据其反应特性（如感受野位置和特征选择性）在空间上进行组织。例如，许多哺乳动物物种的视觉皮层包含方向和定向柱，具有相似偏好的神经元聚集在此。在这里，我们研究这种柱状结构是否存在于小鼠上丘（SC）中，上丘是一个重要的运动处理视觉中心。通过在成年雄性和雌性小鼠中进行大规模生理记录和双光子钙成像股票k线平台，我们发现小鼠 SC 中的方向选择神经元并非根据其偏好方向组织成典型的柱状结构，尽管在少数小鼠中可以看到类似调谐神经元的簇。附近的神经元可以以很大程度上与位置无关的方式偏好相似或相反的方向。无论动物状态（麻醉与清醒、跑动与静止）、SC 深度（最表层与 SC 深处）、研究技术（钙成像与电生理）和刺激类型（漂移光栅与移动点、全视野与小斑块）如何，这一发现都成立。总之，这些结果对最近关于小鼠 SC 中区域特定组织的报告提出了挑战，并揭示了运动方向在这个重要的视觉中心是如何表征的。

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上丘（SC）是一种在进化上保守的结构，在多模态整合和感觉运动转换中发挥着重要作用。在这里，我们确定了小鼠上丘中视觉运动表征的空间组织，小鼠是视觉研究中常用的动物模型。我们的研究结果表明，小鼠上丘中的方向选择神经元在很大程度上独立于视网膜位置来表征刺激方向，并不像最近报道的那样形成方向柱。因此，我们的结果为这种组织提供了更细致、更准确的描述，对理解小鼠上丘的视觉处理和行为学功能具有重要意义。

一、介绍

上丘（SC）或其在非哺乳动物中的同源结构视顶盖，是中脑中一个重要的多模态整合和感觉运动转换结构。在哺乳动物新皮质出现之前，它一直是最复杂的视觉中心。在小鼠中，超过85%的视网膜神经节细胞（RGCs）投射到上丘，使其成为该物种中最突出的视觉中心。目前可用的遗传和病毒工具，以及现代成像和记录技术的进步，使得小鼠视觉系统的功能研究取得了快速进展。特别是，由于上丘在视觉引导行为中的明确重要性以及在其他物种中丰富的上丘研究文献，小鼠上丘受到了越来越多的关注。

上丘（SC）具有两个在进化过程中得以保留的组织特征，即深度特异性分隔和拓扑结构。首先，它是一个分层结构，纤维层和细胞体层交替排列。上丘的输入沿背腹轴按感觉模式组织，浅层为视觉，深层为多模态和前运动。上丘最浅层的细胞层是浅灰质层（SGS），它直接接收来自视网膜神经节细胞（RGC）轴突的输入，这些轴突进入视层（SO），同时也接收来自视觉皮层的输入。其次，各层包含感觉外周或运动指令的拓扑图。例如，视网膜输入有序映射，使得SGS神经元沿前后轴和内外侧轴代表二维视觉场。此外，各层的图谱相互对齐，使上丘能够整合多感觉信息，并启动朝向显著刺激的定向运动。

除了视网膜拓扑图之外，视觉系统中的神经元还可以根据其反应特性（如方向选择性或运动方向选择性）以更高级的组织形式排列。这种图谱在食肉动物和灵长类动物的视觉皮层中可见，但在啮齿动物中却不存在。有趣的是，最近有几项研究报道了小鼠上丘中可能存在的特定区域特征选择性组织。这些报道的模式与高等哺乳动物视觉皮层中所见的柱状组织不同，因为并非所有刺激方向或运动方向都在给定的视网膜拓扑位置上得到体现。如果这些发现得到证实，将对理解小鼠上丘的行为和生态学功能具有重要意义。然而，这些报道的组织模式彼此不一致，且未得到我们实验室研究的支持。

这些研究之间存在一些技术差异，例如所研究的视网膜拓扑位置、动物的状态、视觉刺激以及记录方法。为了应对这些差异，我们开展了一项全面的研究，以确定小鼠上丘（SC）的方向选择性是否具有空间组织性。我们在麻醉和清醒状态下自由奔跑在跑步机上的小鼠身上进行了大规模电生理记录和双光子成像。我们还使用了一个大穹顶来提供几乎覆盖整个视野的视觉刺激，从而能够从小鼠上丘的大区域进行记录。总之，我们的数据表明，方向选择性（DS）神经元的偏好方向在小鼠上丘中并非以区域特异性的方式系统性地呈现，尽管在少数动物中可以看到调谐相似的神经元群。因此，我们的结果提供了关于小鼠上丘空间组织的更细致、更准确的描述。

二、材料与方法

01.动物

本研究使用了成年野生型 C57BL/6 小鼠和转基因小鼠，雌雄均有。转基因小鼠通过将 Gad2-IRES-cre（品系编号 #010802；RRID：IMSR_JAX：010802）与 Ai9（RCL-tdT，品系编号 #007909；RRID：IMSR_JAX：007909）杂交获得。其中包括 16 只用于双光子钙成像（6 只野生型和 10 只 GAD2xAi9），11 只用于麻醉记录，8 只用于清醒记录。所有小鼠均置于 12/12 小时的光照/黑暗周期中饲养，每笼饲养 2 至 5 只。所有实验程序均获得弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会的批准。

02.小鼠上丘的生理记录

我们对麻醉和清醒状态下的小鼠进行了大规模的生理记录。对于麻醉记录，我们遵循了已发表的手术程序。简而言之，通过腹腔注射乌拉坦（1.2 - 1.3 克/千克，溶于 10%生理盐水，腹腔注射）使小鼠麻醉，并辅以氯丙噻吨（10 毫克/千克，溶于 4 毫克/毫升水中，肌肉注射）。阿托品（0.3 毫克/千克，溶于 10%生理盐水）和地塞米松（2.0 毫克/千克，溶于 10%生理盐水）皮下注射。通过直肠探头监测动物体温，并通过反馈加热控制模块将其维持在 37°C。手术期间，使用人工泪液保护眼睛。然后将小鼠置于立体定位仪上，在耳杆上涂抹利多卡因。剃去头皮并去除皮肤以暴露颅骨。用 Metabond 将金属棒固定在颅骨顶部。在右侧大脑半球进行了一次约 2.0×2.0 平方毫米的开颅手术，以便将探针插入上丘。然后将动物转移到记录站，仍置于加热垫上，并用头架固定。在两只眼睛上涂抹了一层薄薄的硅油以替代人工泪液。在实验过程中，通过监测脚趾夹捏反射，必要时追加给予 0.2 - 0.3 克/千克的乌拉坦。

对于清醒记录，首先进行头部固定杆植入的存活手术。手术在异氟烷麻醉（诱导时 4%，维持时 2%，在氧气中，约 0.5 升/分钟）下进行，随后进行上述程序。手术后，给小鼠注射一次卡洛芬（5 毫克/千克，皮下注射），并将其置于加热箱中直至能自由活动。然后将它们放回饲养笼，并每天监测疼痛和伤口愈合情况。手术后两天，小鼠适应头部固定和在圆柱形跑步机上跑步，持续 3 至 4 天。当它们适应装置后进行记录。请注意，开颅手术在记录的第一天进行，麻醉剂为异氟烷，约在记录前 3 小时。

记录是使用由加州大学洛杉矶分校开发的高密度多电极硅微探针完成的。我们使用的特定设计是“128AxN Sharp”，它由两个叉（间距 300 微米）组成。在每个叉上，64 个电极排列成三列，垂直间距为 25 微米，水平间距为 20 微米（图 1C）。探针被小心地插入颅骨切口，并垂直穿过覆盖的皮质以到达上丘。探针尖端位于皮质表面下方约 2.5 毫米处，距中线 0.2 - 1.5 毫米，距λ缝 0.2 - 0.8 毫米。

图1.在大穹顶下对 SC 神经元进行生理记录。A，实验装置的照片，突出显示了视频投影仪、全景镜和供小鼠使用的跑步机。B，用于刺激的穹顶内部视图。使用经纬度网格来调整显示。C，本研究中使用的双叉硅胶探针示意图。每个点表示一个电极触点的位置，每个叉有 64 个通道，组织成三列（垂直间距：25 微米；水平间距：20 微米）。D，由棋盘格反转诱发的所有通道的平均 LFP 叠加图。E，LFP 作为深度（y 轴）和时间（x 轴）的函数的图。每个面板对应电极的一列，冷色调表示负 LFP。每个面板中的垂直虚线标记 LFP 达到最大负幅值的时间点，此时所有通道的 LFP 幅值作为深度的函数绘制（蓝色线）并拟合为高斯曲线（叠加的红色线）。每个面板中的黑色虚线水平线和红色水平线表示估计的皮质表面（详情见材料与方法）。F，与 E 面板类似的图，但为根据局部场电位计算的电流源密度来估计皮质表面。蓝色表示电流汇，其他线条标记的信息与 E 面板相同。G，尖峰分类指标图。隔离度大于 0.96（x 轴）且噪声重叠小于 0.07（y 轴）的单元被归类为单个单元（红色点）。详情见材料与方法。

03.用于生理记录的视觉刺激

视觉刺激在穹顶上显示。该穹顶呈直径为 120 厘米的球体的一部分（图 1A、B）。其大小超过四分之一球体，这样，当动物位于球体中心时，它在水平方向上从 -120° 到 120°（0° 代表垂直子午线），在垂直方向上从 -30° 到 90°（0° 代表眼水平）延伸。这种范围涵盖了小鼠大部分的整个视野，从而为视觉刺激创造了沉浸式环境。

视觉图像由基于“ViRMEn”（虚拟现实 MATLAB 引擎）编写的自定义 MATLAB 脚本生成。图像通过视频投影仪投射到跑步机下方的四分之一球形全景镜上，然后反射到穹顶表面（图 1A）。为了校正穹顶上的失真，生成了一个变换函数，用于确定穹顶表面的三维坐标与投影仪在平面屏幕上使用的二维坐标之间的对应关系。通过修改间距逐渐变小（从 30°、10°、5° 到 2.5°）的网格的每个交叉点，以经验方式使穹顶表面的经线和纬线变直来实现这一点（图 1B）。

使用了四种不同的刺激类型。首先，整个穹顶或较小的区域（50°×50°至80°×80°，覆盖所记录神经元的感受野）会显示方格图案。这用于收集局部场电位以估计上丘表面的深度。每个方格为12.5°×12.5°，其对比度以约20 cd/m²的平均亮度每秒反转一次。其次，使用闪烁的光点来确定感受野的位置。一个直径为10°的圆形亮点在间距为10°的网格上不同位置闪烁。亮点在黑色背景（约1 cd/m²亮度）上亮起（约25 cd/m²亮度）500毫秒，然后熄灭500毫秒，准备下一次刺激。每个网格位置重复此过程10次，顺序为伪随机。然后，我们使用两种不同的移动光点来检查上丘神经元的方向选择性。刺激为在黑色背景上移动的亮点（平均亮度约15 cd/m²），在穹顶表面或较小的区域（30°×30°的正方形，覆盖探针一个分支所记录神经元的感受野）上显示。这些点（直径 4°，在总球面面积上的密度为 450 个点）沿八个方向之一（0 至 315°，以 45°为步长，速度为 30°/秒）移动 2 秒，然后停止 1 秒，再转向下一个方向。所有方向均以伪随机序列重复 10 至 12 次。

04.生理记录的数据分析

来自探针的电信号由 Intan Technologies 的多通道放大器以 20 千赫兹的频率进行记录。尖峰和局部场电位分别经过滤波（尖峰为 300 至 6000 赫兹，局部场电位为 1 至 120 赫兹）并进行分析。

局部场电位用于确定皮质表面的深度（图 1D-F）。我们比较了两种不同的方法。首先，对方法的修改步骤如下：（1）对于每个垂直排列的电极柱（每个叉状电极有三根柱），将由方格反转诱发的 LFPs 在每个电极通道上取平均值（约 120 次重复；图 1D）。然后将 LFPs 作为深度（图 1E，y 轴）和时间（图 1E，x 轴）的函数进行绘制。（2）找到 LFP 达到最大负幅值的通道，并确定其发生的时间点（图 1E，黑色虚线垂直线）。在该时间点，所有通道的 LFP 幅值作为深度的函数进行绘制（图 1E，蓝色曲线）。（3）将这些数据拟合为一个三项高斯曲线（图 1E，红色线）。（4）拟合曲线达到最大负幅值的位置被确定为梭状回中心。皮质表面估计位于梭状回中心上方 250 微米处（图 1E，黑色虚线水平线）。（5）对所有六列电极重复该程序，并将每个尖端的 SC 表面计算为其三列的平均值（图 1E 中的红色水平线）。此外，还使用电流源密度分析。具体来说，在给定的时间点，特定电极的 CSD 值计算为四个相邻电极（两个在上方和两个在下方）之间的 LFP 平均差值。绘制了每列电极的 CSD 随时间变化的曲线。通过线性插值以 10 的因子对 CSD 图进行平滑处理（图 1F）。响应开始时的强电流汇用于定位 SO，其表面估计为该点上方 250 微米。比较了两种方法的估计表面，发现差异仅为 25.6 ± 2.8 微米，支持了两种方法的有效性。本研究使用了第一种方法（图 1E）估计的深度。

使用软件包对离线的尖峰波形进行分类，将其分为单个神经元和多个神经元的尖峰。根据两个指标来区分单个神经元和多个神经元。一个是噪声重叠，衡量检测到的簇与从噪声中随机抽取的尖峰的相似程度。另一个是隔离度，表明一个簇与其他簇的隔离程度。噪声重叠小于 0.07 且隔离度大于 0.96 的簇被归类为单个神经元（图 1G）。此外，信号与噪声比小于 2 的簇被排除，以去除那些受到伪迹污染的簇。随后对分类后的神经元进行分析，以确定它们对特定刺激条件的反应和选择性。通过将所有试验中刺激持续时间内尖峰数量的平均值减去自发率，来计算对特定刺激条件的平均尖峰率。将自发率确定为“空白”条件下的反应率。如果诱发的放电率与自发反应有显著差异且大于每秒两个脉冲，则该单元被认为对该条件有反应。至少有一个反应条件的单元被纳入进一步分析。

对于移动的点，全局方向选择性指数（gDSI）和偏好方向被计算为响应幅度的矢量和，并通过它们的标量和进行归一化：

其中，Rθ 是方向 θ 处的响应幅度。首选方向是向量的角度。对于闪烁点刺激，确定引发 ON 和 OFF 响应的闪烁的网格位置，并分别绘制（图 2B）。从这些响应位置计算质心。细胞的感受野位置被定义为 ON 或 OFF 响应的质心，以幅度较大者为准。

图2.通过大规模生理记录研究上丘的方向选择性。A，一个具有方向选择性的上丘神经元（gDSI = 0.59）的调谐曲线示例。四个插图分别显示了四个方向（0°、90°、180°和270°）的刺激后时间直方图。红色虚线表示自发率。B，一个示例神经元的感受野映射图，每个刺激位置的反应幅度以灰度表示（右侧有比例尺）。分别绘制了对亮点出现（ON）和消失（OFF）的反应。C，沿上丘深度的反应单个神经元的分布。红色条形图标记了方向选择性单元的数量（gDSI > 0.25）。D，每个深度方向选择性单个神经元的百分比。E，所有方向选择性单元（gDSI > 0.25，包括 62 个单个神经元和 149 个多神经元）的极坐标图，展示了它们的偏好方向（图中的角度）和 gDSI（距原点的距离）。F，与 E 相同的图，但仅针对高度方向选择性细胞（gDSI > 0.50，包括 26 个单个神经元和 47 个多神经元）。

最后，通过一个旋转编码器监测动物的运动情况，该编码器在跑步机每转一圈时产生 100 个 TTL 信号（晶体管 - 晶体管逻辑信号）。如果在试验刺激持续时间内速度高于 1 厘米/秒，则认为动物在奔跑。为了确定运动的影响，我们按如下方式计算运动调节指数（LMI）：

其中 Rrunning 是运行条件下的平均响应，Rstationary 是静止条件下的响应。

05.双光子钙成像检测 SGS 反应及数据分析

为确定 SGS 神经元的方向偏好，我们重新分析了近期双光子成像研究中的数据，并进行了新的成像实验。所有实验步骤的详细信息，包括病毒注射、成像、视觉刺激和数据分析，已在之前的论文中给出，仅列出最相关的信息如下。

简而言之，成像实验是在固定头部的小鼠的视交叉上核尾侧极进行的，这些小鼠在跑步机上奔跑（图 6A）。成像实验仅限于该区域，因为这是在保留视觉皮层的情况下唯一能用光学方法触及的部位。具体来说，在成像前几周进行的存活手术中，在λ点处进行了约 2.5 毫米的颅骨切开术。AAV1-Syn-GCaMP6f 病毒载体（100837，pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40，滴度 2×10^13）被注入视交叉上核（在表面以下 200 和 400 微米处各注射 50 纳升）。注射后，将由四片 #1.5 盖玻片玻璃组成的玻璃窗置入颅骨切开处。该窗夹住硬脑膜并将其向前拖动，将横窦向前推，从而暴露视交叉上核表面以进行成像。一个小钛板贴合在颅骨上，以便在记录期间固定头部。

术后 3 至 5 天，小鼠适应了头部固定和在圆柱形跑步机上奔跑。术后 13 至 21 天，在双光子扫描显微镜下开始成像，使用 920 纳米的钛蓝宝石激光器，通过 16×、0.8 数值孔径的物镜进行成像。使用软件（5.4 版）通过共振扫描仪以 2 倍光学放大率获取成像数据，从而得到 412.2×412.2 微米的视野（512×512 像素分辨率）。采集速率为 30 赫兹，分析时使用四帧平均值。

视觉刺激通过心理物理学工具箱在液晶显示器（37.5×30 厘米，L1976；59.7×33.6 厘米，C27F398FW；刷新率 60 赫兹，平均亮度约 50 坎德拉/平方米，伽马校正）上显示。屏幕置于与成像部位对侧的眼睛（右眼）前方 25 厘米处。每次成像视野时，显示器都会稍微移动以使细胞的感受野居中。视觉刺激为正弦漂移光栅（100% 对比度，0.08 周/度，2 赫兹），在屏幕中心的圆形区域（直径 40°）的灰色背景上呈现。使用 12 个方向，每 30°一个。每个光栅刺激条件呈现 1 秒，随后是 3 秒的灰色屏幕，以伪随机方式重复至少 10 次。

我们依照已发表的流程对成像数据进行了分析。在收集到的时间序列的平均图像上手动绘制感兴趣区域（ROI），然后对每个 ROI 中所有像素在每一帧的强度值取平均值，以获得原始的钙离子信号。从原始信号中计算出 ΔF/F0 = (F - F0)/F0，其中 F0 是刺激开始前六帧的基线信号的平均值，F 是刺激开始后八帧的平均荧光信号。如果一个细胞在至少一种刺激条件下其平均 ΔF/F0 值比 F0 高出 2 个标准差，则认为该细胞有反应。然后，将每个刺激条件下的 ΔF/F0 平均值用于后续所有有反应细胞的数据分析。为了量化方向选择性的程度，我们计算了矢量和：

其中 Rθ 是在方向 θ 处的响应幅度（以 ΔF/F0 表示）。偏爱方向即为该矢量的角度。

06.实验设计与统计分析

所有汇总数据均以平均值 ± 标准误表示。不同细胞组间数据比较采用曼 - 惠特尼检验，配对比较采用威尔科克森符号秩检验。连续数据分布比较采用柯尔莫哥洛夫 - 斯米尔诺夫检验。所有分析和图形绘制均在软件中进行，包括使用工具箱 CircStat 进行的圆周统计。细胞和动物的数量以及统计检验的详细信息在结果部分提供。在图中，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。未使用统计方法预先确定样本量，但我们的样本量与该领域报告的样本量相似。由于本研究的实验设计不适用，因此未将动物随机分配到各组。

三、结果

01.麻醉和清醒小鼠的上丘生理记录

为了确定上丘神经元是否根据其偏好方向组织成簇或列，我们进行了大规模的生理记录。我们使用了由开发的 128 通道硅微探针记录上丘的电信号（图 1C）。分别对尖峰和局部场电位数据进行滤波和分析，并按照材料与方法中详述的程序使用 LFP 确定 SGS 表面的位置（图 1D-F）。对记录到的尖峰（包括已分类的单个单元和多个单元）进行分析，以确定其对视觉刺激的选择性（图 1G）。刺激物为在黑色背景上移动的亮点，显示在一个覆盖从 -120° 到 120° 的方位角和从 -30° 到 90° 的仰角的大穹顶上（图 1A、B）。穹顶的大小使得能够在不移动视觉显示器的情况下研究上丘大区域的视觉反应，从而便于对不同动物获得的数据进行比较和组合。

我们从麻醉和清醒的小鼠中都进行了记录。总共从 19 只小鼠（11 只麻醉小鼠和 8 只清醒小鼠）中记录了 n = 464 个视觉反应单细胞。正如预期的那样，探针严重低估了浅层的采样，大多数记录的细胞位于表面以下 300 微米深处，而最表层（表面以下 50 微米内）的细胞很少（图 2C）。总体而言，这些单元中只有 62 个是方向选择性的。就比例而言，浅层的 DS 细胞比例高于深层（图 2D），这与之前关于方向选择性在上丘中具有深度特异性分布的研究结果一致。在 SGS 和 SO（最表层 300 微米）内，20.4% 的细胞（137 个单细胞中的 28 个）是 DS（gDSI > 0.25），略低于使用单钨电极和其他类型的视觉刺激所报告的比例。这可能是由于最表层 SGS 层的采样不足，根据我们的成像数据，该层中大多数反应细胞都是 DS。最后，在麻醉小鼠和清醒小鼠中观察到的 DS 单元的深度分布几乎完全相同（p = 0.28，K-S 统计量 = 0.14，将多单元和单单元合并，双样本 K-S 检验，麻醉小鼠 n = 85，清醒小鼠 n = 126；p = 0.07，K-S 统计量 = 0.32，仅单单元，双样本 K-S 检验，麻醉小鼠 n = 30，清醒小鼠 n = 32）。此外，在麻醉小鼠和清醒小鼠中，首选方向的分布也没有差异（p = 0.30，圆周 Kruskal-Wallis 检验，麻醉小鼠 n = 85，清醒小鼠 n = 126，合并多单元和单单元）。因此，我们将这两个数据集合并在一起，并在本节中共同进行分析。

我们着重对 DS 细胞进行了分析，以确定它们的偏好方向是否以任何区域特异性的方式组织。这些细胞包括 62 个单细胞（30 个来自麻醉状态，32 个来自清醒状态）和 149 个多细胞（55 个来自麻醉状态，94 个来自清醒状态），它们均表现出 DS 反应（gDSI > 0.25）。这些细胞表现出多样的方向偏好，略微倾向于向上运动（在 211 个细胞中，有 76 个细胞的偏好方向在向上方向的±45°范围内，占 36%；图 2E）。当分析高度选择性的细胞（gDSI > 0.5；n = 37/73，51%；图 2F）时，这种偏向变得更加明显。这些细胞的偏好方向似乎形成了四个簇，主要沿着基本方向分布（图 2F）。

接下来，我们根据视网膜拓扑位置分析了首选方向的分布情况。通过在穹顶的随机位置闪烁小光点来确定 DS 单元的感受野（图 2B）。然后将每个单元的首选方向与其感受野位置相对应绘制出来。对于 DS 单元首选方向的组织，未观察到明显的区域特异性模式（n = 191 个对移动点和闪烁点均有反应的单元，gDSI > 0.25；图 3A）。在任何给定的视网膜拓扑区域，都可见到多种调谐偏好。为了量化这一点，我们首先考察了两个最近单元的首选方向差异。DS 单元（gDSI > 0.25）的观察分布与从数据集中随机抽取的分布略有不同（p = 0.02，双样本 K-S 检验；图 3B）。这表明相邻单元倾向于偏好相似的方向。然而，这种倾向非常细微，差异仍覆盖了 180° 的整个范围。此外，我们计算了 DS 单元对的首选方向差异，并将其与它们感受野之间的视网膜拓扑距离相对应绘制出来。在所有感受野距离中，方向差异的平均值和中位数相似（图 3C）。在 0°、90° 和 180° 方向差异附近略高的密度可能反映了细胞偏好沿主方向聚集，且似乎不随感受野距离变化。当使用不同的 gDSI 截断值时（对于 gDSI > 0.50 单位，这种微弱趋势变得不显著；图 3D-F），以及对于来自不同动物的成对组合（图 3A-G）和仅来自同一记录会话的成对组合（图 3H），这一观察结果均成立。最后，我们根据视网膜位置对这些 DS 单元进行分组，并绘制了它们在 30° 间隔的方位角和仰角轴上的偏好方向（图 3I）。同样，从该分析中未观察到系统性变化。总之，这些分析表明，SC 中的 DS 细胞可能显示出与调谐相似的细胞聚集的轻微趋势，但它们并未按照视网膜位置系统性地组织成列。

图3.A，方向选择性（DS）单元的分布情况与其感受野的视网膜位置有关。每个红色圆圈代表一个方向选择性单元（gDSI > 0.25），连接线表示其偏好方向（角度）和 gDSI（长度）。B，每个单元与其最近邻（gDSI > 0.25，A 中的 191 个单元，红色曲线）之间偏好方向差的分布。黑色曲线表示每个单元与从数据集中随机选取的单元之间的偏好方向差（重复 1000 次），蓝色曲线是所有随机抽取的分布的组合。p 值用于比较红色和蓝色曲线。C，成对单元（A 中的 191 个单元）偏好方向差与它们感受野位置之间距离的函数图。红色线表示感受野距离 5°间隔的方向差均值。D-F，与 A-C 相同的图，但仅针对 gDSI > 0.50 的单元。G，与 B、E 相同的图，但仅针对 gDSI > 0.10 的单元。H，与 C、F 相同的图，但仅针对在相同记录中获得且 gDSI > 0.10 的成对单元。H，具有 gDSI > 0.10 的 DS 单元按其感受野的视网膜拓扑位置分布，这些单元被分组到 30°×30° 的区间内。

02.全穹顶与小视觉刺激的比较

上述分析是基于在全穹顶上显示的移动点所引发的反应进行的。我们还使用了覆盖记录神经元感受野的 30°×30°正方形内的移动点来确定方向选择性。在比较这两种刺激条件时，我们发现 DS 神经元的偏好方向基本保持不变（图 4A、B）。对于麻醉小鼠，两种刺激之间的偏好方向差异仅为 15.5 ± 1.7°（但趋势一致，p = 0.02，z 统计量 = -2.27，n = 89），而对于清醒小鼠，这一差异为 31.8 ± 3.1°（无一致趋势，p = 0.91，z 统计量 = 0.11，n = 128；图 4C）。这些微小的差异表明，缺乏区域特异性组织与刺激大小无关。小视觉刺激确实降低了这两种状态下这些单元的 gDSI（麻醉小鼠 p = 1.4e-6，z 统计量 = 4.83；清醒小鼠 p = 1.4e-10，z 统计量 = 6.41）。为了理解这种降低，我们将所有调谐曲线按其偏好方向对齐并取平均值。在麻醉状态下，两种刺激条件下的峰值反应相似（p = 0.22，z 统计量 = -1.23），而在清醒的小鼠中则显示出较小但具有统计学意义的差异（p = 0.0096，z 统计量 = -2.59）。重要的是，全视野刺激抑制了调谐曲线，从而提高了方向选择性（对于相反方向的反应，麻醉状态下 p = 1.66e-8，z 统计量 = -5.65；清醒状态下 p = 1.67e-7，z 统计量 = -5.23；图 4G-H）。出乎意料的是，我们发现麻醉状态下对移动点的峰值反应高于清醒小鼠（全视野刺激下 p = 2.0e-5，z 统计量 = 4.27；小斑块刺激下 p = 5.1e-5，z 统计量 = 4.0513），这可能是由于清醒状态下 V1 区域抑制作用增强所致。

图4.刺激大小不会改变偏好方向。A、B，麻醉（A）和清醒（B）状态下对全视野（x 轴）和小斑点（y 轴）移动点的偏好方向图。C，麻醉和清醒小鼠在两种刺激条件下的偏好方向平均差异（p = 1.82e-5，曼 - 惠特尼检验）。D、E，麻醉（D）和清醒（E）状态下对全视野（x 轴）和小斑点（y 轴）移动点的 gDSI 图。F，两种刺激条件下的 gDSI 差异（麻醉 p = 1.4e-6；清醒 p = 1.4e-10，威尔科克森检验）。G、H，麻醉（G）和清醒（H）状态下对全视野（黑色）和小斑点（蓝色）移动点的平均调谐曲线。蓝色虚线代表平均自发放电率。两种刺激条件下对偏好方向（0°）的反应相似，而在偏好方向的相反方向（±180°）则存在显著差异。麻醉小鼠的峰值反应高于清醒小鼠（全视野比较 p = 2.0e-5，小斑点比较 p = 5.1e-5，曼 - 惠特尼检验）。

03.静止与运动行为状态的比较

接下来，我们分析了运动是否会影响清醒小鼠上丘中方向偏好组织的形成。对于在静止和运动条件下均能产生完整调谐曲线的 DS 细胞（有关这两种状态的分析详情，请参阅材料与方法），我们分析了它们在两种状态下的偏好方向的变化。这些神经元在静止和运动条件下均保持其方向偏好，无论是对全视野移动点还是较小的斑块（全视野条件下 p = 0.60，z 统计量 = -0.53，n = 42；斑块条件下 p = 0.84，z 统计量 = 0.20，n = 25；图 5A）。这与我们之前使用双光子成像对浅层 SGS 神经元的研究结果相似。此外，运动并未导致其 gDSI 系统性地增加或减少，尽管许多细胞在两种条件下存在差异（全视野条件下 p = 0.16，z 统计量 = -1.39；斑块条件下 p = 0.22，z 统计量 = -1.22，n = 25；图 5B）。然后我们分析了这些细胞在偏好方向上的反应幅度，发现它们并未因动物的移动而改变（p = 0.22，z 统计量 = 1.22；全视野 n = 42，斑块 n = 25，图 5C），这再次与我们对最浅层 SGS 神经元的发现相似，且与 V1 区因移动而产生的反应增强不同。我们计算了每个单元峰值反应的移动影响指数（LMI），以量化移动的影响：

该指数接近零，并且在整个 SC 的深度范围内未显示出任何明显的趋势（图 5D）。最后，我们对在相同实验阶段记录的非 DS 单个单元进行了类似的分析。与 DS 细胞类似，在比较运动和静止条件时，未观察到明显的增加或减少趋势（全场：p = 0.18，z 统计量 = -1.35，Wilcoxon 检验；n = 121；斑块：p = 0.42，z 统计量 = -0.81，n = 106；图 5E）。然而，非 DS 细胞的运动依赖性调节似乎更分散。实际上，对于全场，非 DS 细胞的 LMI 分布比 DS 细胞更广泛（p = 0.03，K-S 统计量 = 0.25，双样本 K-S 检验；图 5，比较 D、F），但对于斑块则并非如此（p = 0.72，K-S 统计量 = 0.15，双样本 K-S 检验），这就留下了一种可能性，即如先前所述，在更深的 SC 中某些非 DS 细胞亚型可能会受到运动的特殊调节。

图5.A，DS 神经元的偏好方向在静止（x 轴）和运动（y 轴）条件下基本保持不变。在本图及以下所有图中，对全视野移动点的反应以黑色圆圈表示，对较小区域的反应以蓝色圆圈表示。图中注明了细胞数量。对于 DS 组，全视野 n = 42，小区域 n = 25；对于非 DS 组，全视野 n = 121，小区域 n = 106。B，C，运动和静止条件下 gDSI（B）和峰值反应幅度（C）的比较。D，SC 中 DS 细胞的 LMI 与深度的关系图。E，F，与 C，D 相同的图，但为 SC 中的非 DS 神经元。

04.在清醒小鼠中对浅层 SGS 进行双光子成像

上述实验表明，小鼠上丘中的方向选择性细胞并非按照视网膜拓扑位置系统性地排列。然而，仍有可能在单个小鼠中存在某些聚类现象，当在多个动物中进行综合时这种现象可能会“平均掉”。由于在每只动物中遇到的方向选择性细胞数量有限，这种可能性难以通过电生理记录来测试。因此，我们进行了双光子钙成像实验，可以同时对许多 SGS 神经元进行成像。与我们之前的研究一样，这些成像实验是在清醒且头部固定的具有完整皮质的小鼠上丘尾侧进行的（图 6A）。成像区域的神经元具有远外周视觉空间的感受野，位于 90−120°的方位角（0°代表垂直子午线）和 30−60°的仰角（0°代表眼水平）。成像深度仅限于 SGS 的最上层（在上丘表面以下约 50 微米内，即 sSGS），该层富含方向选择性神经元。我们重新分析了已发表的数据，并为本研究拍摄了新的小鼠图像。我们仅纳入了视野中至少有 20 个视觉反应细胞的小鼠，以分析个体动物之间的变异性（n = 16 只小鼠，691 个细胞）。

图6.利用双光子钙成像技术对浅层 SGS 中偏好的方向分布进行表征。A，实验装置。刺激在距离小鼠眼睛 25 厘米处的可移动屏幕上呈现，并位于视网膜拓扑位置的中心。B，所有反应性神经元（来自 16 只小鼠的 691 个）的偏好方向（方向）和 gDSI（大小）的矢量表示。C，RSI（区域选择性指数）的分布。每条线代表一个 RSI，它是该视野中所有视觉反应性细胞的矢量和。D-G，四个单独的示例，分别代表数据集的第 25 百分位（D）、第 50 百分位（E）、第 75 百分位（F）和第 100 百分位（G）（16 只小鼠中的第 4、8、12 和 16 只，按 C 图中的矢量和从低到高排序）。左列显示视野，彩色圆圈代表细胞的偏好方向（颜色）和 gDSI（圆圈大小）。比例尺：100 微米。中间的极坐标图显示反应性细胞的方向调谐（黑色）。红色线条是所有细胞的矢量和，与 C 图中的红色线条相对应。右侧的图表展示了具有 gDSI > 0.1 的成对感兴趣区域（ROI）之间偏爱方向的差异（Δ°）与距离（µm）之间的关系。10 微米间隔的平均值以红色表示。prefD，偏爱方向；gDSI，全局选择性指数。

在我们成像的区域，显然处于单眼区，许多运动方向都有所体现（图 6B）。大多数 sSGS 神经元的方向偏好大致可分为四组，大致沿四个基本方向（图 6B）。这与我们之前发现的 SGS 中的方向选择性源自视网膜是一致的，在视网膜中，方向选择性神经节细胞偏好四个基本方向之一的运动。然而，这与最近的一项研究结果不同，该研究称单眼区的 SC 细胞几乎完全偏好颞侧方向，而双眼区的细胞偏好鼻侧方向。我们确实观察到对颞侧方向的偏好略高于鼻侧方向（gDSI > 0.25 的有 97 个，gDSI > 0.10 的有 221 个，位于颞侧方向 ±45° 范围内，而位于鼻侧方向 ±45° 范围内的分别为 77 个和 100 个），但四个基本方向都有很强的代表性（图 6B）。

为了探究个体动物中方向偏好的潜在聚集情况，我们随后对每只小鼠分别进行了分析。对于每个视野（图 6D-G 左列），我们绘制了所有视觉反应神经元的偏好方向和 gDSI（图 6D-G 中列）。虽然大多数视野未显示出任何明显的聚集（图 6D-F），但其他一些视野确实表现出对某些方向的偏好（图 6G）。由于每个细胞的偏好方向和 gDSI 以向量形式表示，我们计算了每个视野中所有向量的总和（按标量总和进行归一化），以表示聚集的程度（图 6C）。我们将这种向量总和称为区域选择性指数（RSI），在成像的小鼠中其变化很大，范围从 0.05 到 0.79（平均值：0.32 ± 0.05），图 6D-G 中的示例分别代表数据集的第 25、50、75 和 100 百分位（按 RSI 排序，从低到高，编号为 #4、#8、#12 和 #16）。此外，我们还比较了成对 DS 神经元（gDSI > 0.10）的偏好方向。对于每个个体的所有 DS 神经元对，方向偏好的差异分布在整个 0 - 180° 的范围内（图 6D - G，右列），只有在 RSI 值最高的个体中才偏向 0°（即相似的方向偏好）。重要的是，方向差异并未根据神经元对之间的距离呈现出明显的趋势。彼此靠近的神经元（例如，< 50 微米）可能偏好相似或相反的方向，就像那些相距更远的神经元（例如，约 200 微米）一样，这证实了我们之前在麻醉小鼠中去除皮质后的发现。由于所有小鼠都在相似的位置（即中后侧 sSGS）进行成像，这是由手术程序所限制并由感受野位置所证实的，这些数据表明个体动物之间存在有趣的变异性。

最后，为了探究个体差异是否源于 DS 神经元的不稳定调谐，我们对相同的视野进行了多次成像，并追踪了单个感兴趣区域（ROI）的反应特性。只有那些在不同实验阶段都能可靠识别的 ROI 才被用于此分析。总体而言，我们能够在七只小鼠中追踪多达 107 个神经元长达六周（图 7）。这些细胞中的绝大多数对刺激方向表现出稳定的调谐（图 7B、C），其中 57% 的细胞在连续记录阶段之间的差异小于 10°（图 7D，中位数：7.7°；平均值：16.7 ± 1.4°，n = 373 次连续阶段之间的比较，来自七只小鼠的 107 个神经元）。变化较大的神经元大多是那些 gDSI 较低的神经元（图 7E，r = -0.3，p = 4.15 × 10−9，n = 373）。换句话说，我们的慢性成像实验表明，sSGS 中的 DS 神经元保持稳定的定向调谐，某些动物中观察到的方向偏好簇在不同记录阶段是一致的（图 7A，蓝色簇）。

图7.慢性成像揭示浅层 SGS 方向选择性的稳定性。A，一只小鼠在大约四周内三个不同日子拍摄的同一视野区域。仅显示了根据图 6 中相同颜色标度可可靠识别的感兴趣区域。比例尺：100 微米。B，两个示例神经元在三次成像会话中的调谐曲线，星号标记了相应视觉场位置。C，来自这只小鼠的 26 个神经元的首选方向随记录会话的变化情况。D，连续成像会话之间首选方向差异的直方图（红色圆圈标记中位数，7.8°，n = 373 次比较，来自七只动物的 107 个神经元，每只动物测量了 2 至 6 次）。E，两个会话之间细胞首选方向的差异与其在首次会话中的 gDSI 的关系（r = -0.3，p = 4.15×10-9，n = 373）。

四、讨论

01.小鼠上丘中视觉运动表征的空间组织

在本研究中，我们确定了小鼠上丘中视觉运动表征的空间组织。我们的结果表明，上丘中的方向选择性神经元并非按照其偏好方向形成典型的柱状结构。少数动物确实显示出具有相似调谐的神经元存在一定程度的聚集，但总体而言，相邻神经元可以偏好相似或相反的方向，这在很大程度上与视网膜位置和邻近性无关。这一发现无论是在麻醉状态还是清醒状态下，在浅层和深层均成立，且不受刺激大小和动物运动状态的影响。总之，这些结果比近期关于此问题的报告提供了更细致、更准确的上丘组织描述，因此对理解小鼠上丘的视觉处理和行为学功能具有重要意义。

关于空间组织中视觉特征选择性的争论可以追溯到视觉研究的早期，而且不仅仅局限于小鼠。在对猫的上丘进行研究时，发现当记录到方向选择性单元时，它们的偏好方向往往与其相邻单元相同。同样，在地松鼠的研究中，发现，在垂直穿透上丘时依次记录到的单元偏好相同的方向。此外，研究表明猫的上丘中的方向选择性细胞是视网膜拓扑组织的，它们对离心运动做出反应。然而，所做的实验并不支持猫上丘中存在方向列，尽管确实报告说，他们记录到的绝大多数方向选择性细胞偏好水平运动。据我们所知，这些差异和观察结果尚未得到解决或证实。

是最早研究小鼠上丘神经元感受野特性的学者，包括方向选择性。他们发现，所记录的绝大多数方向选择性神经元更倾向于向上运动。在我们的生理学数据中确实也存在轻微的向上运动偏好，但远未达到那种程度。更重要的是，小鼠上丘中所有方向，尤其是四个基本方向都有所体现。然而，有人提出小鼠上丘可能以位置特异性的方式表示运动方向。例如，有报道称在小鼠上丘的单眼-双眼交界处存在“方向偏好的急剧转变”，即双眼区的方向选择性神经元绝大多数偏好鼻侧运动，而单眼区的则偏好颞侧运动。有趣的是，在该研究中，很少有细胞表现出对向上或向下运动的偏好。最近的一项研究也报告了运动方向的“局部偏向性表征”，其中包含大块的上丘区域，这些区域偏好相似的方向。然而，这两项研究揭示的模式并不一致，且未得到我们实验研究和数据分析的支持。造成这些差异的原因尚不清楚，但可能是由于我们在此揭示的个体差异所致。确实有一些小鼠表现出附近神经元偏好相似方向的集群，但它们只是少数。在未来的研究中应考虑这些个体差异，例如以单个动物为分析单位，并定期更新小鼠品系，包括野生型。

在小鼠的上丘中，也有报道称存在用于表示方向的柱状结构，但两项研究中具体的模式仍不一致。由于在最浅层的层中很少有细胞具有方向选择性，且在生理记录中仅使用了移动的点，所以我们没有研究方向选择性。然而，我们的方向选择性数据与存在方向柱的假设并不一致，这是由于方向偏好与方向之间存在正交关系。尽管如此，仍令人好奇的是，为何在多个物种中，有如此多的研究观察到上丘中存在方向选择性神经元的簇或柱。上丘确实可能以区域特异性的方式编码视觉特征，但可能并非通过我们目前所理解的方向或方向选择性。未来采用更复杂的刺激设计和行为范式的研究或许能帮助解决这个有趣的谜题。

02.运动依赖的上丘反应调节

在本研究中，我们还研究了运动依赖的上丘反应调节。这是受到一系列研究的启发，这些研究表明，当小鼠奔跑时，V1 神经元的视觉诱发反应显著增加。我们之前已经表明，最表层的 SGS 神经元并未表现出如此显著的增强。相反，只有少数神经元在运动期间表现出显著变化，包括反应幅度的增加和减少。在这里，我们将这一发现扩展到更深层和非 DS 上丘神经元。同样，既观察到反应增加，也观察到反应减少，但调节水平更为广泛。观察到的异质性与之前关于小鼠上丘运动依赖调节的研究一致。然而，鉴于已知皮质输入会增加 SGS 反应增益，我们对运动期间缺乏压倒性的增强感到惊讶。这可能是因为皮质-丘脑投射起源的 V1 第 5 层神经元在运动期间仅表现出微弱的增强，其幅度远小于第 2/3 层神经元。最后，我们的数据留下了这样一种可能性，即上丘中的某些细胞类型仍可能受到运动的特异性调节。例如，广视野垂直（WFV）细胞向外侧后核（啮齿动物的丘脑枕）发送输出，已证明其向 V1 传递运动信号。未来需要进行具有细胞类型精度的研究，以确定 WFV 和其他神经元类型如何受到运动的调节。

公司地址：广东省东莞市樟木头镇塑金国际1号楼810

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